封閉劑的基本原理：

固相媒介表面(如elisa板，NC膜或是PVDF膜上等)有很多孔眼，根據(jù)電鉆或抱被，膠上的蛋白被遷移到了膜上，或抗原體/抗體固定不動在板上，蛋白以機(jī)械設(shè)備填充(沉積)和吸咐的方法融合于表面。

蛋白塞入了表面的許多孔眼里邊，但蛋白并并不是持續(xù)的，有很多間隙，并且例如試品孔中間也是有間隙，這種孔眼并沒有填入物品，而抗體也是蛋白，也會被粘附在空的洞里，那樣就有很多非特異性的數(shù)據(jù)信號。

封閉液中的蛋白可以與表面上的空缺裂縫部位融合，一樣以機(jī)械設(shè)備填充(沉積)和吸咐遮蓋的方法融合在膜上，由于有“填充”和“遮蓋”蛋白融合結(jié)構(gòu)域以防止一抗的特異融合，因此有“封閉”的觀點(diǎn)。一樣這二種功效使封閉液中的蛋白可以很堅(jiān)固的融合在空缺部位上。那樣抗體蛋白就不容易被非特異性的吸咐到膜上，而只能跟非特異蛋白融合。

封閉劑應(yīng)封閉全部的未融合結(jié)構(gòu)域而不更換表面上的靶蛋白、不融合靶蛋白表位、都不與抗體或檢測試劑有交叉式反映。

封閉劑的目地

防止高環(huán)境和非特異性雜帶

封閉劑常用實(shí)驗(yàn)試劑的挑選：

最多見的封閉劑是：BSA（牛血清白蛋白）、脫脂奶粉、酪蛋白、果膠和Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液PBST或是TBST。

1、 BSA

BSA是最常見的封閉劑，成份單一適用大部分狀況。若免疫原是偶聯(lián)反應(yīng)BSA的， BSA有較強(qiáng)的抗原性，會造成造成許多的對于BSA的抗體，為防止交叉式反映，不能用BSA、脫脂奶粉等封閉，可以采用酪蛋白或無蛋白的封閉劑封閉。

絕大多數(shù)BSA中有少許的抗體殘余，會造成抗原體/抗體中間的交叉式反映，造成高環(huán)境，雜帶較多或促使本底輻射水準(zhǔn)提高。

2、 血清蛋白

封閉血清蛋白的機(jī)理關(guān)鍵有二點(diǎn)，第一是待檢樣版會有一些與蛋白非特異性融合的成分，進(jìn)而造成環(huán)境過高，因而可以用BSA或血清蛋白封閉掉這一部分非特異性的融合，從這一點(diǎn)看，BSA和血清蛋白沒有顯著差別。第二是待檢樣版中很有可能會出現(xiàn)Fc蛋白激酶，可以和抗體勻速運(yùn)動區(qū)融合，與抗體非特異不相干，封閉血清蛋白中有抗體，因而用血清蛋白可以封閉掉一抗及二抗和樣版Fc蛋白激酶中間融合。BSA則沒法封閉Fc蛋白激酶。

免疫組化選用血清蛋白封閉的較多。封閉血清蛋白一般挑選和二抗同一來源于的，血清蛋白中小動物本身的抗體，事先能和機(jī)構(gòu)中有交叉式反映的結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生融合，不然在后面的流程中假如和二抗產(chǎn)生融合， 會導(dǎo)致環(huán)境。但要留意封閉用血清蛋白中不可以帶有總體目標(biāo)蛋白，且與一抗來源于不一樣。此外二抗因盡量避免選擇小兔子或耗子來源于的，由于這兩個(gè)在親緣關(guān)系上和人們越來越貼近，因此造成交叉式反映的時(shí)機(jī)就非常大，進(jìn)而造成環(huán)境較為高。合適采用來自驢，奶羊，羊等的二抗，環(huán)境相對性就很低。

3、 脫脂奶粉

脫脂奶粉較大的特點(diǎn)是價(jià)格劃算，因此是優(yōu)選，可是在成份相對性繁雜，因此應(yīng)用領(lǐng)域要狹小一些。磷酸化抗體或許會造成環(huán)境提升，除此之外，由于本身帶有生物素,不可以用以生物素標(biāo)識的抗體系統(tǒng)軟件。

嬰兒奶粉蛋白類型比BSA多，而WB膜也好，ELISA板也好，表面的多孔結(jié)構(gòu)都并不是很勻稱的，相對來說，不一樣相對分子質(zhì)量蛋白類型多的嬰兒奶粉(BSA僅僅一種蛋白)，封閉起來更全方位。

脫脂奶粉中帶有少許的生物素和堿性磷酸酶殘余，在應(yīng)用生物素-親和力素系統(tǒng)軟件和堿性磷酸酶標(biāo)識的二抗時(shí)，也會促使高環(huán)境或本底輻射水準(zhǔn)提高。

因?yàn)閶雰耗谭鄣挠行С煞址彪s，并且封閉后的媒介不容易長期性儲存，因而在檢測試劑盒的制取中較少運(yùn)用。

4、 酪蛋白

和BSA功效相近，一般酪蛋白不容易融解。中性化和偏堿情況下含有負(fù)電荷性，與一樣帶負(fù)電膠體金中間存有斥力，而膜一般全是帶正電，會與酪蛋白有一定的粘附功效，用酪蛋白封閉實(shí)際效果好點(diǎn)。

5、 無蛋白化學(xué)物質(zhì)

室內(nèi)甲醛：與PVDF膜表面的多孔結(jié)構(gòu)反映或是融合，使之喪失融合蛋白的疏水力發(fā)電或是空間布局域。

除污劑(司盤-20)：Tween-20是一種非無機(jī)化合物除污劑，有復(fù)性抗原體的功效，與膜疏水性吸咐，有較強(qiáng)的對非特異性吸咐的過柱功效，一樣可以減少蛋白間的吸水功效，可提升非特異的分辨工作能力。在做westen blot時(shí)，用可塑性蛋白質(zhì)或者非正離子除污劑封閉膜上的未融合結(jié)構(gòu)域可以減少抗體的非特異性融合。Tween 這類非無機(jī)化合物除污劑在破乳蛋白時(shí)，不毀壞蛋白的構(gòu)造，可降低對蛋白質(zhì)中間原來的相互影響的毀壞。無機(jī)化合物除污劑如SDS則毀壞蛋白的構(gòu)造。

也有果膠，PEG等也可做為封閉劑。

封閉劑挑選的特殊情況：

1.脫脂奶粉不可以與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)識的抗體一起應(yīng)用，由于脫脂奶粉帶有糖蛋白和生物素。

2.假如封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化非特異抗體剖析磷酸化蛋白遭受危害，由于磷酸酶與印痕膜上的磷酸化蛋白觸碰可讓之去磷酸化。

3.檢驗(yàn)磷酸化抗體時(shí)，不可以應(yīng)用酪蛋白/脫脂奶粉做為封閉劑。

一般封閉劑標(biāo)準(zhǔn)為：

室內(nèi)溫度或是 37℃遲緩搖蕩1～2 h，特殊情況也可 4℃留宿。依據(jù)結(jié)果狀況調(diào)節(jié)封閉實(shí)驗(yàn)試劑的含量和種類。例如脫脂奶粉的封閉實(shí)際效果更強(qiáng)，但有時(shí)候 BSA 比脫脂奶粉更有益于減少非特異性環(huán)境，而有一些抗體則在脫脂奶粉封閉的情形下才可以獲得清楚的環(huán)境。